Fluorometre Kitleri: Hassas Numune Niceliklendirmesi için Pratik Rehber

Moleküler biyoloji laboratuvarlarında, DNA, RNA veya protein floresans kullanan bir florometre setiyle ölçülebilir. Bu testler, belirli bir hedefe bağlandığında daha yüksek sinyali veren boyalara dayanır; toplam UV emilimini ölçmek yerine. Bu seçicilik, örnekler seyrelmiş, hacmi küçük veya emilimi engelleyebilecek diğer maddelerle kontamine olduğunda avantajlıdır.

Tam bir iş akışı genellikle bir analiz reaktifi, seyreltme tamponu, standartlar, analiz tüpleri veya test plakaları ve prosedüre uygun bir florometre içerir. Testin kapsamı, güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir; ayrıca standartların hazırlanmasının tutarlılığı, reaktiflerin uygunsuz ışığa maruz kalmasına karşı koruma ve tüm seyreltmelerin tam olarak kaydedilmesi önemlidir.

Florometre kiti, floresansı ölçmek için gereken tüm malzemeleri ve malzemeleri içerir

Florometre test kitlerinin çoğu, yüksek yoğunlaştırılmış floresan boya, bir analiz tamponu ve referans standartlarından oluşur. Bazı kitlerde tüpler, protokol kartları veya enstrümanlara özel test ayarları da bulunur.

Boya kimyası, testin ne ölçeceğini belirleyici faktör olacaktır. Seçici dsDNA niceliklendirmesi, çift zincirli bir DNA kiti üzerinde yapılmalıdır. RNA, tek zincirli DNA ve protein testleri farklı bağlanma kimyasına dayanır ve birbirinin yerine geçemez.

Bir örnek, dsDNA için ticari kitlerin konsantre test reaktifi, seyrelti tamponu ve önceden seyreltilmiş DNA standartları içerebileceğidir. Uygun uyarılma ve emisyon dalga boylarına sahip tek tüplü veya mikroplakalı florometrelerle uyumlu reaktifler sağlayacak başka sistemler de mevcuttur.

Bazen floresans UV emiliminden daha iyidir

UV spektrofotometrisiyle nükleik asit konsantrasyonunun tahmini, 260 nm'deki absorbansa dayanır. Hızlıdır ve saflık oranları için faydalıdır, ancak tuzlar, serbest nükleotidler, proteinler, RNA, DNA ve diğer organik bileşikler emilim sinyali oluşturabilir.

Floresan testler, seçilen bir analitte daha spesifik olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu, potansiyel kirleticiler içerebilecek düşük konsantrasyon veya örnek doğruluğunu artırmak için faydalı olabilir. Bu nedenle, florometrik niceliklendirme, belirli DNA, RNA veya protein ölçümü için UV emiliminden daha hassas ve seçici olabilir.

Her iki yöntem birlikte kullanılabilir. Floresans belirli bir hedefin konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir ve UV emilimi daha genel bir saflık ölçümü sağlayabilir.

Analiz ve ölçüm aralığı için kiti seçin.

Yaygın florometre kitlerinin birkaç türü mevcuttur, örneğin:

• Yüksek hassasiyetli dsDNA testleri
• Geniş Aralıklı dsDNA testleri
• RNA testleri
• ssDNA testleri
• Protein testleri
• RNA kalite testleri

Düşük konsantrasyonlu ekstraktlar ve hazırlanmış dizileme kütüphaneleri yüksek hassasiyetli bir testle tespit edilebilir. Yüksek konsantrasyonlu örnekler için dar aralıklı testler daha iyidir. Doğrulanan aralık dışındaki örnekler seyreltilmelidir, aksi takdirde sonuçlar daha az güvenilir olabilir.

Yüksek duyarlılık ve geniş aralıklı kitler arasındaki nicelik aralıkları farklı olabilir ve aynı analit için olabilir. Bu nedenle test, sadece örnek adına değil, beklenen konsantrasyona göre seçilmelidir.

Kit florometreyle uyumlu olmalı. Uyarılma ve emisyon kanallarını, tüp/plaka formatını, örnek hacmini, kalibrasyon yöntemini ve programlanmış test seçeneklerini doğrulayın. Bazı florometrelerde dsDNA, RNA ve ssDNA analizi için özel protokoller önceden programlanabilir, bazıları ise özel programlanabilir.

Örnek Hacmi ve Veri Verimliliği için tanımları yazın

Küçük hacim, örneklerin elde edilmesi zorsa veya sonraki deneyler için korunması gerekiyorsa faydalıdır. Bazı tezgah üstü, florometrik sistemlerde birkaç mikrolitre örnek gereklidir, ancak genellikle numune daha büyük hacimli çalışma çözeltisine yerleştirilir.

Veri aktarımı da önemli bir faktördür. Ara sıra yapılan ölçümler ve küçük partiler için tek tüplü florometre uygun olabilir. Birçok örneği olan laboratuvarlar için birden fazla ekstraksiyon örneği veya çoklu dizileme kütüphanesi işleyebilen bir cihaz veya mikroplaka iş akışı tercih edilebilir.

Her enstrüman en pratik değildir. İyi bir sistem, tekrarlayan pipetlemeleri en aza indirmeli, düzenli hazırlığı kolaylaştırmalı ve laboratuvarın düzenli olarak işleyeceği gerçek örnek miktarına eşlik etmelidir.

Tutarlı bir test iş akışını takip etmek

Aşağıda standart bir florometre kiti protokolü bulunmaktadır:

• A. Çalışan çözüm hazırlanmış. İşleyen bir çözüm ortaya çıkar.
• Gerekli standartların oluşturulması
• Her bilinmeyen örnek eklenince
• Örnekleri ve standartları iyice karıştırmak
• Belirlenen süre için kuluçka
• Uygunsuz ışığa maruz kalma reaksiyonlarını önlemek
• Beynin genişliğini ve uzunluğunu ölçmek için bir cetvel kullanmak.9. Beynin bir cetvel kullanılarak doğru ölçümü.
• Örneklerde seyreltme faktörlerinin uygulanması

Kalibre edilmiş pipetleri kullanarak standartları ve örnekleri aynı şekilde hazırlayın ve kullanın. Düşük hacimle pipetleme aşaması yapılırsa, hacimdeki küçük bir hata nihai konsantrasyonda önemli bir fark yaratabilir.

Kuluçka süresi de önemlidir. Bir örneği başta, diğerini ise çok daha sonra almak gereksiz değişikliklere yol açabilir. Bazı testler ayrıca standartlar ile örnekler arasındaki sıcaklık farkına duyarlıdır.

Standartları, boşlukları ve tekrarları uygun şekilde kullanın

Standartlar, analit miktarını floresan yoğunluğuyla ilişkilendirmek için kullanılır. İyice karıştırılmalı, doğru şekilde etiketlenmeli ve kirlenmeden uzak tutulmalıdır.

Bilinmeyen bir örnek boşluğa yerleştirildiğinde, ölçülen sinyal reaktif, tampon, tüp veya arka plan örnek matrisi tarafından sağlanır. Örnek değerliyse, tam konsantrasyon test sınırına yakınsa veya beklenmedik bir sonuç maliyetli bir sonraki süreci etkileyecekse tekrarlama ölçümleri faydalıdır.

Eğer birbirine katılmayan tekrarlı okumalar varsa, sadece iki okumanın ortalamasını hesaplamayın. Pipotleme doğruluğunu, numune karıştırılmasını, kabarcıkların varlığını, tüp temizliğini, kuluçka süresini, sıcaklığı ve seçilen ölçüm aralığını doğrulayın.

Erkekler ve kadınlar acıyı ölçmek için farklı yöntemlere sahiptir

Florometrik sonuçların güvenilir olmamasının yaygın nedenlerinden bazıları şunlardır:

• Hedef için yanlış testin seçilmesi
• Uygun olmayan bir hassasiyet aralığı seçmek
• Depolama ve hazırlık için doğru kabı kullanmamak
• Tutarsız örnek hacimleri ekleme
• Standartlarda veya çalışan çözümde kirleticilerin varlığı.
• Optik yolda baloncuk bırakma tuzakları.
• Çizikli veya uyumsuz tüplerin kullanımı yasaktır. Çizilmiş veya uyumsuz tüplere izin verilmez.
• Aşırı ışık duyarlı reaktiflere maruz kalma
• Bir örnekteki hücre sayısının seyreltme yoluyla azaldığını düşünmeyin.
• Cihazın doğrulanan cihazın menzili dışında kullanılması.

Konsantre örnekler ayrıca pipetleri veya çalışma alanlarını kirletebilir ve gelecekteki düşük konsantrasyonlu örnekleri etkileyebilir. Bu, yeni ipuçları, temiz çalışma yüzeyleri ve mantıklı bir örnek dizisiyle en aza indirilir.

Ölçümü Downstream İş Akışına sürükleerek Downstream İş Akışına bağlayın

Florometre kitleri, PCR, qPCR, klonlama, dizileme kütüphanesi hazırlığı, elektroforez, transfeksiyon ve kontrollü örnek girişini içeren diğer iş akışlarından önce sıkça kullanılır.

Nicel belirleme, örnekleri normalleştirmek, ekstraksiyon verimini karşılaştırmak ve tutarlı reaksiyon girdisi almak için önemlidir. RNA testleri (floresans bazlı) RT-PCR ve cDNA kütüphanesi hazırlığı gibi diğer uygulamalardan önce uygulanır; DNA niceliklendirmesi, PCR, klonlama, transfeksiyon ve yeni nesil dizileme gibi çeşitli sonraki uygulamalarda uygulanır.

Bu nedenle kit seçimi, ölçüm sonrası verilen karara göre şekillenmelidir. Rutin bir ekstraksiyon kontrolü sırasında geniş aralıklı bir test, düşük girdili dizileme çalışmaları için ise daha hassas bir test kullanılabilir.

Reagentleri her zaman uygun şekilde saklayın ve kullanın

Floresan reaktifler ışık, sıcaklık ve kullanım açısından hassas olabilir. Kit talimatlarına göre depolayın, ısıtın, karıştırın ve süresi dolayı tamam olsun. Tüm floresan boyalar dondurulamaz, oda sıcaklığında saklanamaz veya laboratuvar ışığına maruz kalamaz.

Çalışan çözümleri net bir şekilde işaretleyin ve yapıldıkları tarihi kaydetmeyi unutmayın. Orijinal örneklerin değiştiğinden şüphelenmeden önce, reaktif yaşını, reaktif depolama geçmişini, standartları, pipetleri, cihaz ayarlarını, sıcaklığı ve tüp uyumluluğunu kontrol edin.

Son

Florometre kitleri, özellikle değerli veya seyreltilmiş örneklerde DNA, RNA veya proteinin niceliklendirilmesini tespit etmek için hassas ve seçicidir. Güvenilir ölçüm, testin analiz ve konsantrasyon aralığına uygun olmasını, uygun bir florometre kullanımını, standartların tutarlı şekilde hazırlanmasını ve tüm sürecin kontrolünü gerektirir.

En iyi set, en düşük belirtilen tespit limitine sahip kit değildir. Laboratuvarın örnek türü, veri verimliliği, sonraki uygulama ve kalite kontrol gereksinimlerine uygun olan bir cihazdır.

SSS

S1. Fluorometre Set'in uygulamaları nelerdir?

dsDNA, ssDNA, RNA ve bazı RNA kalite testleri için çeşitli kitler mevcuttur. Tarama yönteminin kimyası, hedefe uygun olmalıdır.

S2. Hangileri daha etkili, Fluorometre Kitleri mi yoksa UV yöntemleri mi?

Genellikle belirli bir analitte karşı daha spesifik ve hassas olurlar. UV emilme, yarı final saflık testi ve örneğin genel saflığını ölçmek için geçerli kabul edilebilir.

S3. Ne kadar örnek lazım?

Hacimler farklı test ve aletler için farklı olacak! Gerçekten de, orijinal numuneden sadece birkaç mikrolitre gerektiren birçok tezgah üstü sistem mevcuttur.

S4. DNA RNA testi için kullanılan reaktif nedir?

Genellikle seçici olarak değil. Rutin uygulamada, DNA ve/veya RNA içeriğini ölçmek isteyebilir, bu nedenle bir test bire ya birine ya da her ikisine özgü olabilir.

S5. Farklı kopyalardan elde edilen sonuçlardaki farklılığın nedeni nedir?

Bunlar genellikle pipetleme hatası, yetersiz karıştırma, kabarcık, kirlenme, sıcaklık veya ölçüm aralığı hatasından kaynaklanır.