Kriyo-Elektron Tomografi (Cryo-ET): Numuneniz Yerinde Yapısal Biyoloji İçin Hazır mı?

Kriyo-elektron tomografinin en umut vadeden uygulamaları sadece "Bu protein nasıl görünüyor?" değil, aynı zamanda "Bu yapı gerçekten işlediği yerde nasıl görünüyor?"

Bu ayrım önemlidir. Saflaştırılmış kompleks, biyolojik soru için önemli olan zarları, bitişik kompleksleri, hücre yapısını veya viral yapıyı ortadan kaldırırken mükemmel bir yapısal detay seviyesi sunabilir. Cryo-ET bu zorluğu farklı bir şekilde ele alır; bir vitrinli örneğin birçok projeksiyonunu alarak 3D bir hacim yeniden inşa eder.

Şu anda Longlight, biyolojik montajlar, zarla ilişkili kompleksler ve viral sistemler için yerinde yapısal yaklaşım olarak Cryo-ET'yi sunmaktadır. Kriyo-elektron mikroskopi hizmeti.

Ancak veri toplama için pratik soru şudur:

Biyolojik soru gerçekten tomogram gerektiren bir soru mu?

Mikroskoptan önce Biyolojik Soruyu ele alın

Bazen bilim insanları Cryo-ET'yi tek parçacık analizine benzeterek birinin diğerinden üstün olması gerektiğini öne sürerler.

Genellikle bu elma ile elma karşılaştırması değildir.

Tek parçacıklı kriyo-EM, saflaştırılmış, nispeten homojen bir makromoleküler kompleks biyolojik soruya cevap verebiliyorsa, yüksek çözünürlüklü ortalamalı bir yapıya daha doğrudan bir yol olabilir. Ancak, hedefin konumu/yönelimi, moleküler komşuluğu, zar ortamı veya hücresel organizasyonu önemliyse Cryo-ET çok çekici hale gelir.

Longlight's Neredeyse atomik çözünürlüklü Cryo-EM rehberi tek parçacıklı yol hakkında biraz arka plan sunar; Cryo-ET başka bir soru sorar: Biyolojik bağlam korunduğunda ne görülebilir?

İlk Fiziksel Sınır—Elektron Erişilebilirliği

Bir örnek biyolojik olarak ilgi çekiciyse, bu mutlaka elektrona erişilebilen bir örnek olduğu anlamına gelmez.

Virüsler veya diğer izole organeller, küçük hücreler ve ince çevresel bölgeler için doğrudan kriyojenik tomografi yapılabilir. Bazı yerinde iş akışları, görüntüleme için çok kalın olan daha büyük eozinükleik hücrelerin faydalı iletim görüntülemesi için gerekli olan örnek inceltmeyi içerir.

Hücrelerin ince lamelleri yapmasının iyi bilinen yöntemlerinden biri, kriyo odaklı iyon ışını (FIB) frezelemesidir. Kriyo-FIB ile öğütülmüş ökaryot hücreler, iç yapıların tomografi ve sonraki yapısal analizler için erişilebilir hale getirilmesi amacıyla yerinde çalışmalarda kullanılmıştır.

Örnek planlaması mikroskobun voltajıyla başlamamalı! Elektron ışınının hedefe ulaşacağı 'nereden' ve 'nasıl' gibi şeyler de dahil edilmeli.

Tilt Serisi bir fotoğraf yığını değil, bir Doz Bütçesi.

Cryo-ET, üçüncü boyut hakkında bilgiyi tek bir pozlamadan almaz.

Bu örnek birçok kez eğilir ve bir dizi 2B projeksiyon yakalanır. Bunun nedeni, donmuş biyolojik örneklerin radyasyon hassasiyetinden kaynaklanır ve projeksiyonlara sınırlı bir toplam elektron doz bütçesi verilmelidir. Elektronların geçtiği etkin kalınlık da daha büyük eğim açılarında artar, bu da daha az sinyalin kullanılabilir olabileceği anlamına gelir.

Geleneksel tomografide ise mekanik geometri ve numunenin kalınlığı nedeniyle tam ±90° alma da mümkün değildir. Örneklenmemiş bilgiler, Fourier uzayında bilinen eksik kazağı oluşturur.

Ama daha fazla projeksiyon mutlaka daha iyi anlamına gelmez. Eğim aralığı, doz dağılımı, hizalanma kalitesi, örnek stabilitesi ve hedefin görünürlüğü arasındaki etkileşim dikkate alınmalıdır.

Tekrarlanan bir yapı olan bir Tomograma ihtiyacınız olup olmadığını belirleyin.

Tüm Cryo-ET projeleri neredeyse atomik bir moleküler modelle sonuçlanmak zorunda değil!

Çoğu zaman sadece tomografi bile şu soruya cevap verir: Bir yapı nerede bulunur? Bir zar bozulduğunda ne olur? Viral bileşenlerin organizasyonu nedir? Hangi kompleksler birbirine bitişiktir?

Aynı makromoleküler kompleksin birden fazla kopyası olduğunda farklı bir hedef gösterilir. Tekrarlayan hedefler alt tomogram olarak çıkarılabilir, hizalanabilir, sınıflandırılabilir ve yapısal sinyali artırmak için ortalamaya alınabilir.

Bu makalede Longlight bu rota hakkında ayrıntılı bir açıklama sunuyor. Yeni bir proje için temel sorun baştan ortaya koyulur: Bu benzersiz bir 3D mimari mi yoksa ortalamaya uygun yeterli benzer kopyalar var mı?

Gizli darboğaz hedef lokalizasyonuna dönüşebilir.

En iyi cep telefonu alanını seçmek, teknik olarak iyi bir tilt serisi edinmek kadar önemli olabilir.

Hedefin büyük bir hücrenin sadece küçük bir parçası olduğunu varsayalım. Yanlış bölgeden güzel bir tomogram alsanız bile, yine de yanlış veri setidir.

Bu nedenle, toplanabilmek için hedefin bolluğunu, hücrelerin yaklaşık lokalizasyonunu, tanınabilir morfolojisini, etiketlemedeki mevcut bilgileri ve başka bir lokalizasyon stratejisinin gerekli olup olmadığını dikkate almaları gerekir.

Bu biyolojik harita, zarla ilişkili hedefler, viral toplantı noktaları, organeller veya mekânsal olarak kısıtlanmış kompleksler için alım planının mantığını önemli ölçüde geliştirebilir.

Data Path için oturum öncesi planlama:

Tilt-serisi satın alındığında, bir Cryo-ET projesi tamamlanmış sayılmaz.

Görüntüler yine hizalanmalı, tomogramlara dönüştürülmeli, incelenmeli, hedefler için aranmalı ve segmentlere ayrılmalı, uygunsa parçacık çıkarma, sınıflandırma ve subtomogram ortalamasına aktarılmalıdır.

Bu yüzden istenen teslimat, toplanmadan önce belirlenmelidir.

Longlight'ın mevcut Cryo-EM hizmetinde, nihai yoğunluk haritalarının teslimatına odaklanıyoruz, ayrıca ham veriler ve ara işlem dosyalarının da sunulmasına odaklanıyoruz. Bu, bir araştırmacının işleme kararlarını kontrol etmek, sistem içinde sonraki analizleri yapmak veya veri setine daha sonra dönmek istediğinde faydalıdır.

Platformu Projenin Aşamasına Uydurma

Cihazın kalitesi, belirsiz örnek soruyu çözmek için kullanılmamalıdır.

İlk tarama, numune hazırlığı, parçacık dağılımı, buz kalitesi ve/veya hedef görünürlüğünün maliyetli toplama süresi yatırımından önce iyileştirilip iyileştirilmeyeceğini gösterebilir.

Longlight bugün Talos L120C G2'nin gösterim için kullanıldığı, rutin kriyo-EM/tomografi için 200 kV'da Glacios 2 ve yüksek kaliteli satın alma talep eden 300 kV'da Titan Krios G4'ün yer aldığı aşamalı bir kriyo-EM platformunu duyurdu. Ayrıca, daha geniş bir platform aracılığıyla üst akış protein iş akışlarıyla da bağlantılıdır Protein Uygulaması Yapısal analizi portföyüyle birleştiren portföy.

Araştırma kuralı şudur:

Örnek hazır, bir sonraki enstrümana geç, mevcut olduğu için değil.

Bu, Son Cryo-ET Proje Kontrolü.

Bir örneği Kriyo-elektron tomografiye bağlamayla ilgili olarak, dikkate alınması gereken beş soru vardır:

Yerel mekansal bağlama ihtiyaç var mı? Molekülün ilgi alanı elektron için erişilebilir mi? Hedefin güvenilir bir görüşü var mı? İyy, bir tomogram mı yoksa tekrarlanan parçacıklar mı? Satın alma sonrası hangi tür veri ürünlerine ihtiyaç duyulacağını biliyor musunuz?

Bu cevaplar belirlendikten sonra, ekipman seçimi ve işlem stratejisi çok daha kolay hale gelir.

Kriyo-ET'nin gücü, arındırma sırasında kaybedilen bilgileri korumasıdır. Ancak, bu ancak örnek hazırlığı, görüntüleme stratejisi ve biyolojik soru tek bir proje olarak birlikte tasarlanırsa faydalı olacaktır.

Araştırmacılar Longlight ile danışın Yerinde bir yapısal projede, kullanacakları örnek türü, hedef konum, ulaşmak istedikleri yapı türü ve kullanacakları analizi anlattıktan sonra.

SSS

S1. Kryo-elektron tomografi (Cryo-ET) mi?

Cryo-ET, vitrinlerdeki biyolojik bir örnekten farklı açılardan birkaç görüntü alıp bunu 3D tomograma yeniden yapılandırmayı içerir. Önemli bir faydası, yapısal bilgiyi neredeyse yerli biyolojik ortamda korumasıdır.

S2. Tek parçacıklı kriyo-EM yerine Cryo-ET kullanımı için uygun koşullar nelerdir?

Kriyo-ET'yi düşünün; hücre, zar organizasyonu, moleküler komşular veya doğal mimari konumu araştırma sorusunda kilit bir faktördür. Saflaştırılmış parçacık/ortalanmış moleküler yapı odak noktası olduğunda, SPA genellikle daha doğrudan olur.

S3. Cryo-ET için tüm örneklerde kriyo-FIB frezeleme kullanılmalı mı?

Hayır. Doğal olarak inceltilmiş örnekleri doğrudan görüntülemek mümkündür. Hücrenin daha kalın bölgelerinde, tomografi yapılabilmek için hücrenin elektron şeffaf bir kısmı oluşturmak amacıyla inceltme gerekebilir.

S4. Cryo-ET'de eksik olan nedir?

Tilt serisi sırasında elde edilebilen sınırlı açısal aralıktan 3D bilgi yok. Anizotropiye, yeniden yapılandırma artefaktlarına neden olabilir ve bunlar analizde dikkate alınması gerekir.

S5. Kriyo-ET'de gerçekleştirilen her proje için subtomogram ortalaması yapılması gerekir mi?

Hayır. Tek bir tomogram, morfoloji veya mekânsal organizasyonla ilgili soruları yanıtlamak için yeterli olabilir. Subtomogram ortalamasının değeri, hedefin birkaç benzer kopyasının mevcut olduğunda hizalanma ve ortalamaya alınma olasılığında yatmaktadır.