Moleküler Biyoloji Görüntüleme Sistemi: Jeller ve Lekeler İçin Doğru Platformu Seçmek

Moleküler biyoloji görüntüleme sistemi, bir jel veya zarın dijitalleştirilmiş çıktısını sağlar; bu çıktı görülebilen, nicel ölçülebilir, depolanabilir ve karşılaştırılabilir. DNA ve RNA içeren jelleri, boyalı protein jellerini, kemimilüminesan Western lekelerini, floresan lekeleri ve kolorimetrik örnekleri taramak için ayarlanabilir.

Bir sistem teste uyacak şekilde kullanılmalıdır, tam tersi değil.

Moleküler Biyoloji Görüntüleme Sistemi nasıl çalışır?

Standart bir görüntüleme sistemi, ışık geçirmez bir oda, kamera, lens, örnek aşaması, istenen uyarılma için kullanılabilecek ışık kaynakları, belirli bir emisyon frekansında sadece ışığı geçirebilen filtreler, kameranın görüntüyü kaydetmesi için yazılım ve görüntüyü analiz etmek için yazılım içerir.

Nükleik asit jellerinde ise cihaz, floresan leke üzerine UV, mavi veya başka uygun ışık tutar. Beyaz ışık, görünür protein jelleri için sıkça kullanılır. Kimyasal lüminesans Western blotlarda üretilen ışık kendi yapımları ve kimyasal bir reaksiyondan kaynaklanıyor, bu yüzden hassas bir kamera ve karanlık görüntüleme odasına ihtiyaç vardır, ancak örnekte yüksek yoğunluklu ışık yoktur.

Bazı hepsi bir arada platformlar, tek bir kabinada jel dokümantasyonu, kolorimetrik görüntüleme, kemilyünüsans ve floresans yeteneklerine sahiptir. Örneğin, bio-Rad, nükleik asit ve protein jelleri ile kemilyünesan lekeleri görüntülemek için sistemler sağlar ve bu sistemler görünür bir kanal, uzak kırmızı ve yakın kızılötesi floresan kanallarla genişletilebilir.

Çalıştırdığınız örneklerle başlayabilirsiniz

İlk başlamanız gereken yer laboratuvar tezgahında—teknik özellikler sayfasında değil!

Agaroz jellerine odaklanan bir eğitim laboratuvarı için, UV, mavi ışık ve beyaz ışık görüntüleme tek türler olabilir. Doğru bir protein araştırma laboratuvarı, hassas kemimilüminesans ve birkaç floresan kanal gerektirir.

Thermo Fisher, görselleştirme sistemlerini sadece görselleştirme sağlayanlara, yazılım analizi ile kimyasal lüminesans Western blot ve çok kanallı floresan görüntüleme sunanlara ayırıyor. Faydalı bir hatırlatma: jel dokümantasyon sistemi, çok modlu moleküler görüntüleyici olarak mutlaka bir alet seviyesi değildir.

Uyarılma kaynağını ve filtreyi boyaya eşleştirin

Her floresan boya, aydınlatması ve ışığın yayımı için optimal bir dalga boyluğu aralığına sahiptir. Görüntüleme sistemi, boyayı uyarmak için uygun bir ışık kaynağına ve emisyon (floresans) fotonlarının kameraya ulaşmasını sağlayan ve boyayı uyarmak için kullanılan ışığı reddeden bir emisyon filtresi ile donatılmalıdır.

Aşağıda şunları içeren sistemlere örnek gösterilmiştir:

• UV geçirimli aydınlatma
• Mavi ışık transilluminasyonu
• Beyaz geçirimli ışık
• Beyaz yansıtılan ışık
• Görünür floresan uyarılma
• Yakın kızılötesi floresan uyarılma

Işık kaynağı sayısı ile kalitesi arasında bir korelasyon yoktur. Anahtar nokta, kurulan dalga boyları ve filtrelerin laboratuvarda zaten kullanılan lekeler, antikorlar ve floresan etiketlerle uyumlu olup olmadığıdır.

Bir sistem satın almadan önce laboratuvarın reaktif listesini kontrol ederek uygulamaların desteklediğinden emin olun. Lütfen tüm floresan boyaların yakalayamayacağını unutmayın çünkü sistem "floresans görüntüleyici" olarak adlandırılır.

Kemimilüminesans ve Floresans çok benzerdir

Kemilyünesan western blotlamada ışık, genellikle bir antikor enzimi ve bir lüminesans substrat üzerine kurulu kemimilüminesans reaksiyonla üretilir. Sinyal zamanla değişir – görüntüleme, reaktif için önerilen çalışma süresi aralığında başlatılmalıdır.

Floresan ile yapılan western blotlama, uyarılmanın dış ışığını gerektirir. Deneyleri çoklu olarak kullanmak için kullanılabilir, böylece aynı membranda farklı floresan kanallarla birden fazla hedef tespit edilebilir.

Kimyasal lüminesans genellikle hassas ve rutin tespit için kullanılır. Çoklama veya kararlı sinyal yakalama veya nicel karşılaştırma kritik olduğunda, floresans genellikle seçilir. Tek bir en iyi yöntem yoktur; çünkü bu, testin gereksinimlerine, hedef miktarına, antikorlara, kullanılan etiketlere ve analiz amaçlarına bağlıdır.

Bir laboratuvar rutin olarak her iki testi de yapıyorsa, önerilen sistemin testlerin hem olduğu haliyle hem de karmaşık donanım değişiklikleri olmadan yapılmasına izin vermesini sağlamalıdır.

Fotoğraf çekerken, dinamik aralık ve doygunluğu göz önünde bulundurun

Bazı blot çok güçlü bir grup ve birkaç zayıf grup olabilir. Güçlü bant, pozlama zayıf sinyalleri gösterecek kadar uzun olursa doygunlaşabilir.

Kameranın piksellerinin artık yakalayamayacağı kadar çok ışık olduğunda. O noktadan sonra gösterilen bandın görünüş netliği korunur ancak yoğunluk seviyesi nicel karşılaştırma için kullanılamaz.

Dinamik aralık, görüntüleme sisteminin tek bir görüntüde kaydedebildiği zayıftan güçlü sinyallere kadar olan aralıktır. Daha geniş bir dinamik aralık, soluk ve yoğun bantların kaydını daha kolay sağlar ve hiçbir bilgiyi kaybetmeden yapar.

Bazı görüntüleme platformları doygun pikselleri algılayabilir, uygun bir pozlama önerebilir veya çoklu pozlama kullanabiliyor. Deneme yanılma görüntüleme sayısını azaltabilirler, ancak iyi bir deneysel tasarımın yerine geçmezler. Örnekler aşırı yüklense bile, test aşamasında düzeltilmeli ve çok güçlü antikor sinyalleri de düzeltilmelidir.

Otomatik Pozlama kullanımından kaçınılmalıdır

Otomatik pozlama, birden fazla kişinin enstrümanda sırayla kullandığı veya sinyal gücünü ölçmeyi zorlaştıran faktörler varsa faydalı olabilir.

Bazı sistemler kısa başlangıç pozlamaları elde eder ve ardından buna dayanarak genel bir maruziyet önerir. Işık kaynağı, odak ve uygulama ayarları başkaları tarafından otomatik olarak seçilir.

Bu, rutin görüntülemenin daha hızlı olmasını sağlayabilir, ancak lütfen operatöre kontrol edin. Kontrol et:

• Not: Önemli bantlar için doygunluk belirtilmiştir.
• Arka planın üstünde zayıf bantlar görülebilir
• Tüm görüş alanı tam örnekle kapsanır.
• En iyi sonuçlar için doğru görüntüleme modu kullanıldı.
• Gerekli filtre ve tepsi kullanıldı
• Aşağıdakiler nicel analizler olup maruz kalma davalarını gerektirir:

Otomatik ayarlar iyi bir başlangıç noktasıdır, ancak görüntüyü incelememek için bir bahane değildir.

Çözünürlük, hassasiyet ve görüş alanının hepsinin doğru olduğundan emin olun

Çözünürlük, kameranın çektiği görüntü için önemlidir, ancak megapiksel sayısı kameranın görüntü kalitesinin göstergesi değildir.

Ayrıca, yeterince duyarlı, düşük arka plana sahip, iyi optiğe sahip, uniform ve laboratuvarda kullanılan jeller veya zarları barındıracak kadar geniş görüş alanına sahip faydalı bir sisteme sahip olmak da önemlidir.

Kimyasal lüminesans sinyaller zayıfsa, çok hassas bir kamera gerekecektir. Bantlar arasındaki mesafe ne kadar büyükse, o kadar az çözünürlük gerekir; Bantlar arasındaki mesafe ne kadar azsa çözünürlüğe sahip olmak o kadar önemlidir ve ayrılacak örnek özelliği ne kadar küçükse, o kadar fazla çözünürlük gerekir.

Satın almadan önce görüntüleme yerine en büyük laboratuvar jel tepsisi, leke veya çoklu jel tepsiyi yerleştirin. Büyük bir jel birkaç görüntüye bölünürse, çaba boşa harcanır ve karşılaştırmalar daha zor olur.

Görüntülerin tutarlı şekilde alındığından emin olun

Görüntüleri karşılaştırırken aynı koşullarda fotoğraf çekmek önerilir.

Görüntüleme modunu, ışık kaynağı türünü, filtreyi, pozlama süresini, binne, odak, örnek konumu, analiz ayarları ve arka plan düzeltmesini yazın. Gerekirse, kaydedilen protokolleri tekrar kullanın.

Boyama veya detamine yapıyorsanız, nukleik asit ve protein jelleri için koşulların aynı olduğundan emin olun. Kontrol örneklerinin yüklenmesini, antikor konsantrasyonunu, substratın zamanını ve zarın Western blotlarda işlenmesini kontrol edin.

Görüntüleyici yalnızca yerleştirildiği örneği kaydedebilir. Eşit olmayan transferi, çok fazla arka planı, aşırı yüklü koridorları veya antikor özgüllüğünün eksikliğini düzeltemiyor.

Analiz Yazılımını Test Et

Görüntü analiz yazılımıyla yapılan yaygın görevler zor olmamalı ve yazılım sonucun üretimini engellememeli.

Bazı eğlenceli işlevler şunlar olabilir:

• Şerit ve bant tespiti
• Moleküler ağırlık tahmini
• Arka plan çıkarma
• Bant yoğunluğu ölçümü
• Doygunluk uyarıları
• Normalleşme
• Multipleks kanal göstergesi
• Görsel açıklaması
• Veri ihracası
• Kullanıcı veya deney kaydedildiğinde.

Yerleşik analiz rutin işler için bir avantajdır ve masaüstü yazılımları hem detaylı analiz hem de nihai şekil hazırlamak için daha uygun olabilir. Örneğin, termo balıkçı görüntüleme sistemleri, gemi içi alım ve analiz ile harici yazılım iş akışları sunar.

Orijinal görüntü dosyasını her zamanki gibi mümkün olduğunca uzun süre sakla. Görüntülenen görüntüyü ayarlamak için ham erişim verisini değiştirmemeli.

Numunelerinizin güvenli olduğundan emin olmak için önlemler aldığınızdan ve ekstra adımlar attığınızdan emin olun

UV görüntüleme cihazının yaydığı doğrudan veya yansıtılan ultraviyole ışık, gözlere ve cilde zarar verebileceği için uygun koruma sağlamak önemlidir. Açık UV ışık kutusuna kıyasla daha az olan görüntüleme odasının kapatılmasıyla poziyet azaltılabilir.

DNA jelden çıkarılacaksa, uygun nükleik asit boyaları için mavi ışık uyarısı kullanmak daha iyi olabilir. Beyaz ışık görüntüleme, görünür protein lekelerini görüntülemek için UV kullanımını ortadan kaldırır.

Sistem ayrıca numuneden numuneye kontaminasyonun önlenmesini sağlayacak şekilde tasarlanmalıdır. Numune tepsilerini yıkayın, tampon dökülmelerini mümkün olan en kısa sürede temizleyin ve filtrelerin, lenslerin ve görüntüleme yüzeylerinin temizlenmesi için üretici yönergelerine uyun.

Sistemin Optik Bir Cihaz olarak kurulduğundan emin olun

Moleküler biyoloji görüntüleyicisi sadece ara sıra temizlenemez.

Işık kaynakları zamanla aşınabilir, filtreler çizilebilir, numune tepsileri lekelenebilir ve toz görüntü kalitesini etkileyebilir. Laboratuvarlar aydınlatmayı takip etmeli, tepsileri ve filtreleri kontrol etmeli, satın alma protokollerinin yedeklerini almalı, yazılımı dikkatlice güncellemeli ve bakım dokümantasyonunu sürdürmelidir.

Görüntü kalitesi iyi değilse, tüm süreci gözden geçirin ve kamerada ya da zincirin geri kalanında bir sorun olup olmadığını kontrol edin. Bu, leke, numune veya substrat, pozlama ayarları, ışık kaynağı veya filtre tarafından kaynaklanabilir.

Son

En faydalı platform her zaman en fazla özelliğe sahip olan değildir. Diğer kullanıcıların yeniden üretebildiği doğru aydınlatma, hassasiyet, dinamik aralı, yazılım, görüntü alanı ve iş akışı sunan cihazdır.

İyi görüntülemesi örnek hazırlama aşamasından itibaren başlar. Cihaz deneyi kaydeder, ancak testin hazırlanması dikkatlice yapılır ve alım tekrar tekrar yapılırsa, görüntü (kayıt) anlamlıdır.

SSS

S1. Moleküler Biyoloji görüntüleme sistemi neyi yakalayabilir?

DNA ve RNA jellerini, protein jellerini, kemimilüminesan western lekelerini, floresan western lekelerini ve ayarlara bağlı olarak kolorimetrik zarları yakalayabilir.

S2. Jel Dokümantasyon Sistemi ile Western Blot Imager arasındaki fark nedir?

Her zaman değil. Temel jel sistemi yalnızca UV, mavi ve beyaz ışık görüntüleme ile görüntülemeyi destekleyebilir ve Western blot görüntüleme cihazları hassas kemilyünlüminesans veya çok kanallı floresan algılama gerektirebilir.

S3. Dinamik aralık neden önemlidir? Dinamik aralık neden önemli?

Geniş bir dinamik sinyal aralığı, zayıf ve güçlü sinyallerin en güçlü olanların doygunluğu olmadan yakalanmasına olanak tanır. Bu özellikle nicel analiz için geçerlidir.

S4. Otomatik Exposure güvenilir mi?

Başlangıç maruziyet aralığını belirlemek faydalı olabilir. Operatör ayrıca doygunluk, arka plan, zayıf sinyaller ve görüntüleme modu gibi diğer faktörleri de gözlemlemelidir.

S5. En iyi Görüntüleme Modu nedir?

Kullanılan mod, örnek, boyama, etiket ve analiz hedefine bağlıdır. Işık kaynağı, filtre ve kamera ayarları teste bağlıdır.