UV Transilluminator: Jel Görselleştirme İçin Doğru Sistemi Seçmek ve Kullanmak

sonuç ise sorunlu bir UV transilluminatör olması. DNA, RNA veya protein bantlarını basit bir şekilde, ultraviyole ışığı boyalı bir jelden geçirerek okur. Operatör daha sonra jeli inceleyebilir, fotoğrafını çekebilir veya istediği bandı kesip daha sonra onunla çalışabilir.

Çoğu sorun güç anahtarı dışındaki şeylerle ilgilidir. Bunlar yanlış dalga boyu, uyumsuz aydınlatma ve leke, çok uzun pozlama ve UV korumasının eksikliğinden kaynaklanır.

İyi bir UV transilluminatör iş akışı, sadece sample'a ve enstrümanı kullanan kişiye minimum maruziyet oranı olan net bantlar sağlamalıdır.

UV Transilluminatör nasıl çalışır

Jel daha sonra elektroforize edilir ve genellikle çıplak gözle görülemeyen moleküler parçalar geride bırakılır. Lekelenecek malzemeye yapışan veya onunla etkileşime giren floresan bir boya. Boyalı jel daha sonra aydınlatılmış yüzeye aktarılır ve boya ultraviyole ışıkla uyarılır, göze görünen bir floresans yayar.

Koyu arka plan ve parlak bantlar, parçaların boyutunu yaklaşık olarak tahmin etmeye, örneklerin yoğunluğunu karşılaştırmaya, amplifikasyon ürünlerini kontrol etmenizi veya jel çıkarımı için malzeme bulmanızı sağlar.

254, 302 ve 365 nm standart dalga boylarında birkaç UV transilluminatör mevcuttur. Bazıları tek bir dalga boyu sunar, bazıları iki veya üç ta; hangisinin en iyisi enstrüman türüne ve istenen dalga boyuna bağlıdır. Jel görüntüleme ve elektroforez uygulamaları, 302 nm civarında geniş bir UV yelpazesi kullanır.

Gerçek uygulama için dalga boyundaki Seçeneği seçin

Floresans yoğunluğu, numuneye verilen hasar ve leke uyumluluğu dalga boyu seçimiyle etkilenir.

302 nm bir kaynak, floresan boyalı DNA ve RNA jelleri görüntülenirken genellikle kullanılır; çünkü genellikle yüksek yoğunluklu sinyal verir ve bu kaynakla bilinen birçok nükleik asit boyası kullanılabilir. Rutin jel kontrolleri ve dokümantasyon için kolay bir çözüm.

UV kaynaklı DNA hasarının azaltılması en güçlü sinyalden daha önemliyse, yaklaşık 365 nm olan uzun dalga UV kullanımı düşünülebilir. Thermo Fisher, DNA'ya maruziyeti en aza indirmeyi önerir ve jelden DNA elde edilirse yaklaşık 360 nm daha uzun bir dalga boyu kullanılmasını önerir.

DNA-jellerin rutin görüntülenmesi için kısa dalga UV (yaklaşık 254 nm) kullanımı otomatik olarak kabul edilmemelidir, ancak bazı laboratuvar çeviricileri mevcuttur. Floresan malzemeye ve laboratuvardaki uygulamaya bağlı olarak kullanılmaya uygundur.

Bu nedenle en büyük dalga boyu en etkili seçenek değildir. Lekeye uyan ve örneği sonraki adım için yeterince koruyan olan.

Farklı bir renkte bir ışık kaynağı için farklı bir renkte jel leke kullanın

Transilluminatör ve jel boyama tek bir optik sistem olarak değerlendirilmelidir.

Farklı uyarılma ve emisyon özelliklerine sahip farklı boya türleri vardır. Bir lekenin UV yansıtıcılığı yüksek, mavi ışığı yansıtma oranı düşük olabilir ve tam tersi de olabilir. Kamera filtresi ayrıca yayılan floresansın geçmesine izin vermeli ve istenmeyen uyarılma radyasyonunun geçişini önlemelidir.

Yeni bir testten önce:

• Lekeyi uyaran dalga boyları lequel'dir. Lekeyi uyaran dalga boyları 'luequel'lerdir.
• Fotoğraf filtresi kullanıp kullanmama kararı, bireysel fotoğrafçı tarafından belirlenir.
• Boyama maddesinin özellikleri (DNA, RNA veya protein)
• Jel kesilecek mi yoksa kesilmeyecek, nasıl belgelenecek?
• Eğer ışık kaynağı yeni bir teknolojiyse, mevcut görüntüleme sistemiyle onu yakalamak için bir yöntem var mı?

Örneğin, SYBR Safe boyalı jeller, uygun floresan ekipmanı kullanılarak UV veya mavi ışık filtresi kullanılarak görüntülenebilir - etidyum-bromid görüntüleme için kullanılan filtre uygun olmayabilir.

Bir görüntü çok solgun ise, jelde mutlaka çok az DNA olduğu anlamına gelmez. Neden uygunsuz uyarılma dalga boyu, yanlış kamera filtresi, eski kullanılan UV lambalar veya çok fazla oda ışığı olabilir.

DNA'daki hasar geri alınacaksa, UV ışınlarına maruz kalmayı sınırlayın

Nükleik asitler UV ışığından zarar görmeye hassastır. Bu, bir araştırmacının jelden bir DNA bandı çıkarmak ve kalan DNA'yı klonlama, ligasyon, dizileme veya diğer uygulamalar gibi sonraki uygulamalarda kullanmak istemesi durumunda önemlidir.

Uzun süreli maruz kalma, DNA'nın çizilmesine ve diğer hasarlara yol açabilir; bu da elde edilen DNA'nın kalitesini etkileyebilir. Thermo Fisher'ın belirttiği gibi, uzun süre UV'ye maruz kalmak, DNA'ya zarar verebilir ve bu da alt klonlama gibi sonraki uygulamalarda etkili olabilir.

UV görselleştirme gerekiyorsa:

1. Işığı açmadan önce kesme aletlerini ve toplama tüpünü kurun.
   1. En düşük ayarı ayarlayın, böylece net bir bant elde edilir.
   1. Maruziyet minimumda tutulmalıdır.
   1. Mümkünse, UV ışığı için daha uzun bir dalga boyu düşünün.
   1. Aynı jeli tekrar tekrar gözleme.
   1. Seçilen bandı not edin ve kaynağı kapatın.

Klonlama için uyumlu bir mavi ışık dönüştürücü, özellikle hassas klonlama işleri için daha uygun olabilir. Renkler mavi ışıkla uyarılabilir ve mavi ışıkla DNA'ya daha az zarar verdiği tespit edilmiştir.

Aydınlatma Tekdüzeliği'ni Kontrol Et

Transilluminatör izlenecek alanın eşit şekilde aydınlatmasını sağlamalıdır.

Yüzeyin bir tarafı diğerinden daha yoğunsa, aynı bantlar jel üzerindeki konumlarına bağlı olarak değişen yoğunluklara sahip olur. Bu özellikle, aynı laboratuvarda şeritler karşılaştırıldığında ve/veya yarı nicel analiz için kullanılan bir görüntü kullanıldığında önemlidir.

Düzenlilik, lambaların durumu, lambaların düzeni, filtreler, yüzeylerin temizliği ve cihazın optik tasarımı tarafından etkilenir. UVP bağlamında tekdüze aydınlatma, çeşitli bantlarda ve şeritlerde sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için önemlidir.

Her zaman arka planı inceleyin, tüm jel boyunca eşit olup olmadığını kontrol edin, ardından bant yoğunluğuna göre karar verin. Aynı jelin yüzeyin farklı bir bölümüne aktarılması, aydınlatma sorununun gelişmesine yardımcı olabilir.

Doğru izleme alanını kullanın

Yüzeyin aydınlatıldığı alan jelin üzerine yeterli olmalı ama fazladan bir sıra alanı kaplamamalıdır.

Küçük hücre standart mini-jeller için harikadır. Daha büyük platformlar, büyük formatlı jeller veya yan yana birden fazla jel için daha iyi olur. Ticari sistemler genellikle yaklaşık 20 x 20 cm ve daha büyük farklı aydınlatılmış alanlara sahiptir.

Tüm jel yüzeyde düz olmalı. Koruyucu filmdeki kırışıklıklar, fazla tampon veya düzensiz tepsi nedeniyle bantların yansıması ve bulanıklaşması mümkündür.

İzleme yüzeyinin temiz olduğundan emin olun; Sadece UV filtreyle uyumlu malzemeler ve temizlik maddeleri kullanın. Görüntüler çizikler, lekeler veya kurumuş tampon birikintilerinden etkilenebilir.

Kullanıcıyı UV maruziyetinden korumayı unutmayın

UV Transilluminatör standart bir izleme lambası DEĞİL, laboratuvarda kullanılmak üzere tasarlanmış yüksek yoğunluklu bir ışık kaynağıdır.

UV ışınlarına doğrudan veya döllü olarak maruz kalmak göz ve cilt hasarına yol açabilir. Stanford'un laboratuvar güvenlik yönergeleri, bir transilluminatör kullanımı için aşağıdaki önlemleri listeler: transilluminatör kullanılırken erişimi kontrol altında tutmak, yansıtıcı yüzeyleri transilluminatörden uzak tutmak ve cilt ile gözlerin korunması gerektiğini gösteren tabelalar asmak.

Her zaman cihazla birlikte verilen koruyucu üst, kalkan veya kapalı görüntüleme kabinesini kullanın. Jelle çalışmayı gerektiren laboratuvar uygulamaları, yüzü kapatmak, eldiven takmak, sıkı bir laboratuvar önlüğü giymek ve cildi UV engelleyicilerle kaplamak zorunda kalabilir.

Normal güvenlik gözlüklerinin UV dalga boyundaki engeli olduğunu varsaymayın. Cihaz için belirlenmiş uygun koruyucu ekipmanları giyin ve laboratuvarın radyasyon güvenliği kurallarına uyun.

Daha iyi pozlama kontrolü, açık ışık kutusu üzerinde çalışmak yerine kapalı jel-dokümantasyon sistemi ile güvenli kilitle sağlanır. Bazı sistemler, UV modunda çalışırken görüntüleme kapısının açılmasına izin vermez.

Eğitimciler tutarlı bir izleme akışı oluşturmalıdır

Gereksiz değişkenliği en aza indirmek için kullanılabilecek basit bir parça var:

• Elektroforez ve Boyama 1. Elektroforez ve 1 boyama.
• Boyanın doğru dalga boyunda olduğundan emin olun.
• Jel tepsisinin dışının temiz ve kuru olduğundan emin olun.
• Gerekli UV dalga boyunu ve yoğunluğunu seçin.
• Jeli merkezdeki izleme alanına serin.
• Koruyucu kalkan/görüntüleme kutusunu kapatın.
• Görünür bantlar oluşturmak için mümkün olan en kısa pozlama süresini kullanın.
• Fotoğrafı uygun emisyon filtresiyle çekin.
• Jeli hareket ettirirken UV ışığını kapatın.
• Kullandıktan sonra yüzeyi sil.

Birden fazla deney yapılırsa, leke konsantrasyonu aynı olmalıdır; görüntüleme filtresi, pozlama süresi, yoğunluk ayarı ve kamera koşulları da aynı olmalıdır.

Transilluminatörü Görüntüleme İş Akışına Takın

Kullanıcı bir jel incelemesi gerekmiyorsa, tezgah üstü bir transilluminatör kullanılabilir. Daha zorlu uygulamalar için kamera, koyu muhafaza, filtreler ve görüntü analiz yazılımı dahil olmak üzere tam bir jel-dokümantasyon sistemi gereklidir.

Entegre sistemler görüntü yakalama, bant ölçümü, dokümantasyon ve düzenli jel analizi için kullanılabilir. Bio-Rad, kontrollü aydınlatma ve otomatik görüntü alma ile analiz yazılımı sunan jel-dokümantasyon platformlarını karakterize eder.

Karar, laboratuvarın görüntüyle ne yapacağına bağlı olacak. Bir araştırma laboratuvarında, eğitim laboratuvarı net bir görsel onaya ihtiyaç duyabilir, bir araştırma laboratuvarı ise izlenebilir görüntü dosyaları, tutarlı pozlama ve nicel bant analizi gerektirebilir.

Işık Kaynağını asla çıkarmayın

UV lambalar açıkmış gibi görünse bile, zamanla çıkışlarını kaybetmeye başlarlar. Yoğunluk azaldığında, operatör pozlama süresini artırır, bu da tutarlılığın azalmasına ve daha fazla örnek pozlamasına yol açabilir.

Üreticinin lamba bakım yönergelerine uyun. UV radyometre, görsel tahminden daha objektif bir ölçüm olur ve UVP, ışın ölçümünün, bir UV kaynağının kullanım ömrünü izlemek için uygun bir yöntem olduğunu belirlemiştir.

Önerilirse lambaları set olarak değiştirin, izleme filtresini iyice temizleyin ve bakım tarihlerini not edin. Flüoresan UV lambalar da cıva içerebilir ve yerel gereksinimlere göre tehlikeli atık olarak ele alınmalı ve bertaraf edilmelidir.

Son

Jel görselleştirme için UV transilluminatör kullanıldığında, bunu hızlı ve net yapabilir, ancak iyi sonuçlar almak için sadece ultraviyole ışıkta parlak olamaz.

Dalga boyu boyama ve sonraki kullanımlar için uygun olmalıdır. Aydınlatma mümkün olduğunca eşit olmalı, pozlama mümkün olduğunca kısa olmalı, kamera filtresi yayılan floresansla aynı olmalı ve kullanıcı ışık kaynağından gelen UV poziyetinden korunmalıdır.

Doğru cihaz, jelin boyutuna, boyama yöntemine, görüntüleme gereksinimlerine, örneklerin geri alınma iş akışına ve laboratuvar ortamı için güvenlik kontrollerine uygun olanıdır.

SSS

S1. UV Transilluminatör ne için kullanılır?

Esas olarak elektroforez jellerinde lekelenmiş floresan etiketli DNA, RNA veya protein bantlarını görselleştirmek için kullanılır. Ayrıca jel-dokümantasyon sistemine entegre edilebilir.

S2. DNA jelleri için aşağıdaki dalga boylarından hangisi yaygın olarak kullanılır?

Orta frekans UV'nin (yaklaşık 302 nm) yaygın bir kullanımı jellerin rutin görüntülenmesi içindir. Son seçim, leke ile aynı şekilde uygulanmalıdır.

S3. UV ışığı DNA'yı mutasyona dönüştürür mü?

Evet. Uzun süreli maruz kalma DNA hasarına yol açabilir ve DNA ile sonraki uygulamaların klonlanabilirliğini azaltabilir.

S4. Hangisi daha etkili: Mavi Işığı mı yoksa UV Işığı mı?

Kullanıcıya UV hasarı ve/veya DNA hasarı endişe duyuyorsa, uyumlu boyalar için mavi ışık kullanımı önerilir. Bazı bilinen lekeler için bile UV daha iyi uyarılma sağlayabilir.

S5. Jel Bantlarda neden bir zayıflık var?

Bunun nedeni düşük örnek konsantrasyonu, uygunsuz bir boya, uygun olmayan dalga boyu veya filtre, yaşlanan lambalar, çok fazla arka plan ışığı veya kötü boyama olabilir.