G Protein-Bağlı Reseptörü: Hücre Sinyalinden İlaç Keşfine Kadar

G proteinine bağlı reseptörler, kısaca GPCR'ler, hücrelerin hücreler dışından gelen sinyallere yanıt vermesine yardımcı olan zar proteinleridir. Bu sinyaller hormonları, nörotransmitterleri, lipidleri, peptitleri ve ışığı kapsayabilir.

GPCR'lerin yedi transmembran yapısında açık bir yapı ortak noktası olsa da, aynı şekilde işlemezler. Bir deneyin sonuçları, reseptörün ligandına, hücrenin çevresine, reseptörün ifade seviyesine ve sinyal partnerlerine bağlı olabilir.

Araştırmacılar, GPCR biyolojisini çözmek için bir bileşiğin bir reseptörü "aktivasyon" ölçümünün ötesine geçmek zorundadır. Tüm yol, zamanlama, analiz formatı, kontroller ve hücre modeli önemlidir.

G Protein Bağlı Reseptör: Nedir?

Tipik bir GPCR'nin hücre zarını kaç kez geçeceği 7'dir. Hücre dışı kısımları sinyal moleküllerine, hücre içi kısımları ise G proteinlerine, arrestinlere, kinazlara ve diğer sinyal moleküllerine bağlanır.

GPCR'ler, IUPHAR/BPS Farmakoloji Rehberi tarafından Sınıf A, Sınıf B, Sınıf C, Frizzled ve Yapışma reseptörleri gibi birçok ana sınıfa ayrılır. A sınıfı en büyüğüdür ve adrenerjik, dopamin, opioid ve muskarinik reseptörler gibi iyi bilinen hedefleri içerir.

Yapı olarak benzer olmalarına rağmen, GPCR'ler çok çeşitli sinyal setini tanıyabilir. Bu sayede duyusal algı, kardiyovasküler düzenleme, metabolizma, bağışıklık fonksiyonları, ruh hali, hareket ve çok daha fazlasını gerçekleştirebilirler.

GPCR'ler nasıl aktive olur?

Bir ligand reseptöre bağlanır ve reseptörün şeklini değiştirir. Bu konformasyonel değişimin bir sonucu olarak, reseptör hücre içi sinyal proteiniyle etkileşime girebilir.

Birçok GPCR'nin ilk ortağı alfa, beta ve gama alt birimlerinden oluşan heterotrimerik G proteini bulunur. Reseptörlerin aktivasyonu, alfa alt biriminde GSYİH'nin GTP ile değiştirilmesine yol açar. Aktive edilen bileşenler daha sonra aşağı akış enzimlerini, iyon kanallarını ve ikinci habercileri etkiler.

G proteinlerinin en popüler aileleri şunlardır:

• Gs, genellikle döngüsel AMP artışına neden olur
• Döngüsel AMP indirgeme enziminin yaygın adı gi/o'dur.
• Fosfolipaz C ve kalsiyum yollarını sinyal eden Gq/11 yolu
• Rho ailesi proteini ve sitoskelet yanıtları G12/13 ile kontrol edilebilir.

Bu ders kitabı açıklaması faydalı, ancak çizgi nadir bir sinyal biçimidir! Tek bir reseptör birden fazla G proteini üzerinden sinyal gönderebilir ve optimal sinyal iletimi ligand ve hücre tipine bağlı olarak değişebilir. GPCRdb, reseptörlerin G proteinleri, GPCR kinazlar ve arrestinlerle etkileşime girebileceğini, bunun çeşitli hücre içi sinyal yollarının oluşumuna yol açabileceğini belirtir.

Tutukluların rolleri

G proteini aktive edildikten sonra, GPCR'ler tarafından sinyal gönderilmesi durmaz.

GPCR kinazlar, aktive edilmiş reseptörleri fosforile edebilir. Arrestinler daha sonra reseptörle etkileşime girebilir, reseptörün G proteinlerine daha fazla bağlanmasını engelleyebilir, reseptör içselleştirilmesini kolaylaştırabilir ve sinyal iletiminin diğer yollarında yer alabilir.

Bu nedenle, arrestin'in işe alınması "kapalı anahtar" olarak değerlendirilemez. Reseptör ve deneye bağlı olarak, bu işlem, reseptörün taşımı, duyarsızlaşma, geri dönüşüm, bozulma veya diğer sonraki etkileri etkileyebilir.

Hem G protein sinyalasyonu hem de arrestin aborasyonu bir bileşiğin tam farmakolojisinin önemli ölçütü olduğundan, genellikle birlikte ölçülürler.

Bu bölümdeki makaleler, aynı reseptörün farklı yanıtlara yol açabileceği yolları inceliyor

GPCR'ler sadece açma/kapama anahtarları değildir.

Çeşitli ligandların reseptörün farklı konformasyon fazlarına bağlandığı bulunabilir. Bir ligand türü bir G protein yolunda yüksek aktivasyon seviyelerine neden olabilirken, diğer yol daha fazla arrestin alımına veya farklı sinyal profiline yol açabilir. Genellikle fonksiyonel seçicilik/yanlışlı sinyal olarak adlandırılır.

Hücrelerin arka planları da önemlidir. Aynı reseptör iki farklı laboratuvarda bulunabilir, ancak hücrelerde farklı miktarda G proteinleri, arrestinler, kinazlar, enzimler veya endojen reseptörler bulunur.

Bir diğer sorun ise reseptörlerin ifade seviyesi olabilir. Aşırı ekspresyon, düşük aktivite seviyelerine yanıtları artırabilir ve/veya bağlanma tercihlerini değiştirebilir; ayrıca kısmi agonistin hücrede doğal dokuya göre daha güçlü bir aktiviteye sahip olmasına yol açabilir.

Bu nedenle bir sonuç, sadece reseptörün değil, tam bir deneysel sistemin davranışının göstergesi olarak alınmalıdır.

Biyolojik soruya dayalı Testi Seç

Hiçbir GPCR testi tüm soruları yanıtlayamaz.

cAMP Testleri

Gs veya Gi proteinli reseptörler genellikle cAMP kullanılarak ölçülür. Gs yanıtı cAMP'de artışa yol açabilir ve Gi yanıtı uyarılı cAMP üretiminin inhibisyonuyla belirtilebilir.

Bu testler konsantrasyon-yanıt çalışmalarında, agonistlerin karakterizasyon çalışmalarında ve antagonist çalışmalarında yaygın olarak kullanılır. Antagonist deneylerinde, test bileşiğinin hücrelere maruz kalmasından sonra agonistin bir konsantrasyonu genellikle uygulanır.

Kalsiyum Testleri

Gq-bağlı reseptörler, kalsiyumun hücre içi testleriyle incelenebilir. Hızlı ve yüksek verimlilik ölçümü verebilirler, ancak yanıt kısa süreli olabilir ve hücrelerin işlenişine, boyaların yüklenmesine, reseptör ifadesine ve ölçüm süresine büyük ölçüde bağlı olabilir.

GTPγS Bağlama

GTPγS testleri, G proteini aktivasyonu sürecinde ölçülecek en erken olaylardan biridir ve genellikle membran hazırlıklarında agonistin aktivitesini doğrulamak için kullanılır. Test, reseptör–G protein etkileşimine oldukça yakın olduğundan, sonraki okumalarda yaşanan bazı amplifikasyonu azaltabilir.

Arrestin Recruiting

Arrestin testleri, yol yanlımı, ligand-spesifik sinyali, reseptör kaçakçılığı ve reseptör duyarsızlaştırmasını incelemek için kullanılabilir. En iyi şekilde bir reseptörün aktivasyonunun genel göstergesi olarak değil, bir G protein testi ile birlikte kullanılırlar.

Canlı Hücre Biyosensörleri

BRET ve FRET teknikleri (ve diğer biyosensör yöntemleri) canlı hücrelerdeki sinyal olaylarını zamanın bir fonksiyonu olarak takip edebilir. Buradan en büyük satış noktası kinetik bilgidir: Araştırmacular sinyal göndermesinin ne zaman başladığını, ne zaman zirve ve sonra düştüğünü ölçebiliyorlar, çünkü birden fazla uç noktayı ölçüyorlar.

Doğru bir GPCR Deneyi Yapın

İyi bir test, cihaza değil, biyolojik teste dayanır.

Öncelikle, reseptörün ifade edildiğinden ve hücre zarında doğru konumda olduğundan emin olun. Düşük yanıt, ligandın düşük aktivitesinden değil, kötü reseptör ekspresyon/kaçakçılığından kaynaklanabilir.

İkinci olarak, uygun kontrol cihazları ekleyin. Genellikle bilinen bir agonist, bilinen bir antagonist, araç kontrolleri, transfekte edilmemiş hücreler ve aşağı akış testi için reseptörden bağımsız bir kontrol gerekebilir.

Son olarak, tam bir konsantrasyon-yanıt eğrisi gerçekleştirin. Bir bileşiğin yalnızca bir konsantrasyonunun değerlendirilmesi, bir testle ilgili güç, etkililik, kısmi agonizma, toksisite veya spesifik olmayan bir girişim için güvenilir bir ölçüm olamaz.

Zamanlamanın da standartlaştırılması gerekiyor. Kalsiyum sinyali aldığınızda, birkaç saniye içinde ve birkaç saat sonra gen ifadesini ölçtüğünüzde, ikisini karşılaştırmak mümkün değil. Aynı reseptörü ölçen testler, yanıtın farklı aşamalarını ölçmek için kullanılabilir.

Son olarak, ortogonal yaklaşımla önemli sonuçları doğrulayın. Bir bileşiğin cAMP testinde aktif olduğu tespit edilirse, bunu başka bir faydalı testle, bağlanma testi veya reseptöre özgü pozitif kontrol ile doğrulamak en iyisidir. Assay Guidance Manual, lead optimizasyonuna doğru ilerlerken GPCR hitlerinin dikkatli doğrulama, kalite kontrolü ve farmakolojik karakterizasyonu önerileceğini önerir.

İlaç Keşfi için GPCR'ler

GPCR'ler, fizyolojinin birçok alanında yer aldıkları ve hücrede yüzeyden ifade edildikleri için ilaç keşfinde kilit bir rol olmaya devam etmektedir. GPCRdb, insan hormonlarının %25'inin bu reseptör ailesinin üyelerine yanıt olarak yer aldığını ve tüm ilaçların yaklaşık üçte birinin bu reseptör ailesinin üyelerini hedef aldığını tahmin etmektedir.

Geleneksel programlarda ana arama hedefleri ya agonistler ya da ana ligand bağlama sitesine bağlanan antagonistlerdi. Allosterik modülatörler, yol yanklı ligandlar, reseptör – dönüştürücü seçiciliği, bağlanma kinetiği ve yapı tabanlı bileşik tasarımı da şu anda araştırılmaktadır.

Yapısal biyolojinin ortaya çıkmasıyla birlikte, bu daha mümkün hale geldi. GPCRdb artık deneysel olarak belirlenen reseptör yapıları, reseptör-ligand kompleksleri ve reseptör–G protein kompleksleri dahil olmak üzere GPCR'lerin bağlanma bölgelerini ve aktivasyon durumlarını karşılaştırmak için araçlar içeriyor.

İyi yapıya sahip bir bileşik, iyi yapıya sahip olsa bile fonksiyonel teste tabi tutulmalıdır. Bir molekül, güçlü bağlanma eğilimiyle uygun bir hedefe bağlanabilir ve amaçlanan hücresel yanıtı tetiklemeyebilir ya da alternatif olarak, bir molekül istenen yola girebilir ancak doğru şekilde değil.

Son

G proteinine bağlı reseptörler en iyi şekilde sadece bir membran anahtarı değil, esnek bir sinyal sistemi olarak düşünülebilir.

Reseptör ligand bağlanmasına yanıt olarak şeklini değiştirir, reseptör partnerlerini hücrede bulur ve hücrenin ortamı sinyalin akışını belirler. Bu yüzden testlerin seçimini, reseptörlerin ifadesini, yolun zamanlaması, kontrolleri ve ortogonal doğrulamayı dikkate almak önemlidir.

GPCR araştırması ve ilaç keşfi için en iyi sonuçlar genellikle yapısal bilgilerin ve birden fazla fonksiyonel testin birleşimi sonucu elde edilir.

SSS

S1. GPCR'nin ana işlevi nedir?

GPCR, hücre yüzeyi reseptörü olup hücre dışı bir sinyale yanıt verir ve hücre içi bir yanıt üretir. Cevap G proteinleri, arrestinler, ikinci haberciler, iyon kanalları veya gen düzenlemesi yoluyla olabilir.

S2. Tüm GPCR'ler aynı G proteini tarafından mı aktive edilir?

Hayır. Çeşitli reseptörler, çeşitli G proteinlerini (Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13 veya çoklu sinyal partner(leri)) aktive etmeyi tercih edebilir.

S3. Yetim GPCR nedir?

Yetim GPCR, doğal aktive edici ligandın kesin olmadığı bir reseptördür. Bu reseptörler temel araştırma ve ilaç geliştirme için hâlâ büyük öneme sahiptir.

S4. Peki, GPCR taraması için hangi testi kullanmalı?

"En iyi" test, ele alınan soruya ve reseptörün sinyal yoluyla ilgili olacaktır. Yanıtın farklı yönleri cAMP, kalsiyum, GTPγS, arrestin ve canlı hücre biyosensör testleriyle ölçülebilir.

S5. Araştırmacıların birden fazla test kullanmasının nedeni nedir?

Bir test yalnızca bir yolu ölçebilir veya formata özgü girişimler içerebilir. Eğer gözlemlenen etkinin gerçekten reseptörle ilişkili olduğu ortogonal testle gösterilebilirse, bunun gerçekten reseptörün etkisi olduğu sonucuna varılabilir.