Kromatin Kesme: Tekrarlanabilir bir ChIP İş Akışı Nasıl Oluşturulur

Kromatinin kesilmesi, ChIP protokolündeki en hassas adımlardan biridir. Çok büyük parçalar çözünürlükte azalmaya ve zayıf bağışıklık presipitasyonuna yol açabilir. Çok yüksek yoğunlukta kesme epitop, DNA–protein kompleksi ve geri kazanılabilir madde hasarına yol açabilir.

Tüm örnekler için tek bir program çalışmaz. Kromatinin ultrasonik enerjiye verdiği yanıt, her hücre tipi, fiksasyon, başlangıç materyali ve kromatin lizisinin verimliliği ile numunenin hacmine göre farklıdır. Tüm hazırlık süreci, sadece sonikasyon süresini değiştirmek yerine, güvenilir sonuçlar elde etmek için kontrol edilmelidir.

Ne Kırkma Kromatin mi?

İmmünopresipitasyondan önce, kromatinin kesilmesi, çapraz bağlı kromatini daha küçük DNA-protein parçalarına ayırır. Antikorlar, belirli bir transkripsiyon faktörü, histon veya histon modifikasyonu ile ilişkili kromatini zenginleştirmek için kullanılabilir.

İmmünopresipitasyondan sonra, çapraz bağlantılar tersine çevrilir, DNA arındırılır ve zenginleştirilmiş bölgeler qPCR veya dizileme ile analiz edilir. Longlight ChIP-seq çözümleri protein-DNA etkileşimleri ve genom genelinde düzenleyici sitelerin incelenmesinde destek sağlar.

Kromatin kesmesi, saflaştırılmış DNA parçalanmasından farklıdır çünkü nükleozomlar, ilişkili proteinler ve formaldehit çapraz bağlantıları DNA erişilebilirliğini ve mekanik özelliklerini değiştirir.

Fragment Neden Boyut Önemli mi?

Büyük parçalar, elde edilen DNA'nın protein bağlanma bölgesinden çok daha uzun olabileceği için konumsal çözünürlüğü azaltır. Ayrıca, çevrelerinde spesifik olmayan ama fiziksel olarak bağlı bölgeler olduğunda arka plan yükseltmeleri de yapabilirler.

Çok kısa parçaların mutlaka daha iyi olduğunu varsaymayın. Aşırı işlem miktarı bağışıklık veriminin kaybı, hassas epitopların kaybı veya uygun olmayan bir kütüphane profiline yol açabilir.

Optimal parça boyutu, ChIP protokolü, biyolojik hedef, kullanılan antikor ve sonraki analizlere göre değişecektir. Bu nedenle, laboratuvarlar sadece evrensel ortalama boyut değil, kendi testleri için kabul edilebilir bir dağılım belirlemelidir.

Ya Kırkma çapraz bağlama ile mi?

Çapraz bağlama, protein-DNA etkileşimini sürdürürken, çok yoğun çapraz bağlama kromatinin parçalanmasını zorlaştırabilir ve antikor epitlerini gizleyebilir. Zayıf veya geçici etkileşimler, yeterli fiksasyon nedeniyle kaybolabilir.

Fiksasyon süresi, örnek türüne, reaktiflerin konsantrasyonuna, hücre yoğunluğuna ve hedef proteine göre değişir. Söndürme ayrıca düzgün olmalıdır çünkü örneklerin davranışı daha fazla çapraz bağlanma sırasında değişecektir.

Eğer örnek, akustik enerji miktarını artırmasına rağmen kesmeye karşı direnç göstermeye devam ederse, bu temel sorunu çözmez. Daha agresif bir program benimsenmeden önce çapraz bağlama ve söndürme koşulları dikkate alınmalıdır.

Neden Hücre Girdisi ve Liziler Önemli mi?

Az miktarda fazla hücre oluşursa, düzensiz şekilde kırılan kalın, yapışkan kromatin oluşabilir. Çok az başlangıç malzemesi kullanım kayıplarını artırabilir ve kromatin kalitesini değerlendirmeyi zorlaştırabilir.

Deneyler arasındaki hücre sayısı eşitlenmelidir. Doku örnekleri, hücre dışı materyal, yapısal farklılıklar ve eksik ayrışma nedeniyle heterojen lizat elde etme riski yüksek olduğundan ekstra özen gerektirir.

Sonikasyondan önce, çekirdeklerin ve kromatinin etkili salınımı çok önemlidir. Eksik lizis, parçalanmamış çekirdeklerin veya hücre kümelerinin oluşmasına neden olabilir ve bu kümeler numunenin geri kalanından farklı şekilde enerjiye maruz kalabilir.

Ne Kadar Odaklanmış? Ultrasonikasyon Kontrolü Geliştirmeye Yardımcı Olur mu?

Enerjinin doğrudan numuneye iletilmesi gereken prob sonikatörleri kullanılır. Değişkenlik ve kirlenme potansiyeli, prob konumu, daldırma derinliği ve operatörün tekniğinden kaynaklanabilir.

Odaklanmış ultrasonikasyon, akustik enerjiyi bir bağlantı ortamı aracılığıyla kapalı bir örnek kabına yönlendirmek için kullanılır. Bu, daha kontrollü ve temassız bir işleme ortamı sağlar.

bu BoFU-100 odaklı ultrasonikator sıcaklık kontrollü DNA, RNA ve kromatin kesilmesini sağlar. The BoFU-1600 sistemi birden fazla örnek işlenirken çok kanallı laboratuvar iş akışı seçeneği sunar.

Hangi parametreler optimize edilecek?

Akustik yoğunluk, görev döngüsü, işlem süresi, döngü sayısı, duraklama süresi, örnek hacmi ve örnek sıcaklığı önemli değişkenlerdir.

İlk optimizasyon sırasında her seferinde bir ana değişkeni değiştirin. Yoğunluk ve süre ve/veya hücre konsantrasyonu aynı anda değiştirildiğinde, her iki değişiklik nedeniyle sonucun daha iyi mi yoksa daha kötü mü olduğunu belirlemek zor olabilir.

Makul bir başlangıç noktası etrafında küçük bir koşul matrisini test edin ve parça dağılımları ile DNA kurtarımını karşılaştırın

- En kısa DNA ile sonuçlanan en güçlü tedavi DEĞİL!

Bir program seçildikten sonra, programı hücre ölçüm girişi, tampon, tüp ve örnek hacmiyle birlikte kaydedebilirsiniz. Bu eşlik koşullar olmadan, sonikasyon parametreleri güvenilir şekilde yeniden üretilemez.

Neden öyle Önemli Örneklerin Soğuk tutulması mı?

Ultrasonik tedaviye ısı etkileri eşlik edilir ve kromatin ısıya duyarlı olabilir. Protein hasarı, antikor tanıma kaybı ve artan değişkenlik ısı faktörü olabilir.

Tüm koşu boyunca soğutma aynı olmalıdır (denemeler arasındaki diğer dönemde bile). Bir buz kovası ile cihaz arasındaki tüplerin hareket hızı örnek sıcaklığını etkilememelidir.

Kırkma Nitelik Kontrol: Nasıl?

Kesmeden sonra temsilci bir aliquot alın. Çapraz bağlantıları tersine çevirin, DNA'yı temizleyin ve agaroz jel elektroforezi veya uygun otomatik bir parça analizörü ile tüm parça boyut dağılımını değerlendirin.

İşlenmemiş çapraz bağlı kromatini arıtılmış DNA gibi değerlendirmeyin. Görünen boyut, proteinler ve çapraz bağlantıların neden olduğu göç değişikliği nedeniyle yanıltıcı olabilir.

Materyalin çoğu, laboratuvarın "kabul edilen" aralığı sınırları içinde olmalı ve yüksek moleküler ağırlıklı materyal popülasyonu az veya hiç büyük bir popülasyon olmamalıdır. Elde edilen DNA miktarı da ölçülmelidir; çünkü DNA'nın büyük bir kısmı kaybedildiyse iyi bir profil değerli değildir.

Neden var Tutarsız Kromatin Kesme mi?

Bunlar, değişken fiksasyonu, yanlış hücre sayıları, eksik lizi, değişken örnek hacmi, değişken tüp türleri ve sıcaklık kaymalarından kaynaklanır.

Köpürme veya hava kabarcıkları akustik bağlantıyı etkileyebilir. Bu nedenle, örnek tüpleri aynı şekilde doldurulmalı, kapalı ve yerleştirilmelidir. Yöntem geliştirme için, doğrulanmış tip/doğrulanmış partiden tüpler tercih edilir.

Bir partideki sonuçlar arasında farklılık varsa, bu numune konumu etkileri veya örnek hazırlama zamanlamasının tutarsız olabileceğini gösterebilir. Basit bir çalışma günlüğü, biyolojik prosedürler veya aletlerle ilgili herhangi bir varyasyon olup olmadığını görmek için faydalı olabilir.

Yeni bir örnek türü nasıl optimize edilmeli?

Gerçek deneyi temsil eden malzemeyle küçük fiksasyon ve akustik matrisle başlayın. İlk test için değerli veya değiştirilemez bir örnek kullanmayın.

Parça dağılımı, DNA geri kazanımı ve immünopresipitasyon performansını değerlendirin. Kesmeden sonra, kromatinin ChIP için uygunluğu pozitif kontrol antikoru ve bilinen hedef lokusları kullanılarak değerlendirilebilir.

Optimize edildikten sonra, kritik parametreleri bir SOP'ta belirleyin. Kromatin hazırlığı için odaklanmış ultrason hakkında daha fazla bilgi için lütfen Longlight'ın ChIP başvuru sayfası.

Son

Sadece ultrasonik güçle ilgili değil, güvenilir kromatin kesme yapmak için. Fiksasyon, hücre girişi, hücre lizisi, örnek geometrisi ve akustik ile sıcaklık koşullarının hepsi uyumlu olmalıdır.

Optimal yöntem, doğru parça dağılımını sağlar ve bağışıklık sistemi performansını ve malzemenin geri kazanımını korur. Her laboratuvar, numune tipi ve partisi ile kullanmak istedikleri ChIP iş akışı hakkında ekipman ve uygulama desteği için iletişim sayfası üzerinden Longlight ile iletişime geçebilir.

SSS

Q1. Kromatin kesme neden gerekiyor?

IP için çapraz bağlanmış kromatini daha küçük parçalara ayırır. Kontrollü boyutta fragmentlerin kullanımı, ChIP-qPCR ve ChIP-seq çözünürlüğünü artırır.

Q2. Kromatin az kesilirse ne olur?

Çok büyük parçalar, çözünürlük kaybına ve spesifik olmayan arka planın artmasına neden olabilir. Tedaviyi otomatik olarak uzatmadan önce fiksasyon, liz ve akustik koşulları yeniden değerlendirmeyi düşünün.

Q3. Kromatini aşırı kesmek mümkün mü?

Evet. Çok fazla tedavi kullanılırsa, iyileşme bozulur veya protein epitopları ile DNA-protein kompleksleri zarar görür. Daha kısa parçalar kullanmak her zaman iyi bir fikir değildir.

Q4. Sonication sırasında kromatinin buzda tutulması gerekir mi?

Evet. Düşük sıcaklıktaki işleme stabildir, bu da ısının örnekler ve proteinlere verdiği zararı azaltmaya yardımcı olur. Numuneler ile partiler arasında sıcaklık sabit olmalıdır.

Q5. Tek bir kromatin var mı-oaTüm hücre tiplerine uygulanabilir bir halka programı mı?

Genellikle hayır. Hücre yapısı, kromatin yoğunluğu, fiksasyon yanıtı ve örnek konsantrasyonu arasındaki fark vardır ve yeni örnek türleri sınırlı optimizasyona tabi tutulmalıdır.